重磅 | 3大策略：如何通過優(yōu)化T7 RNA聚合酶提升mRNA藥物安全性？

mRNA技術(shù)作為一種新興的生物技術(shù)，具有巨大的應(yīng)用潛力。從 mRNA 疫苗到 mRNA 藥物，這一技術(shù)為疾病的預(yù)防和治療提供了全新的思路。然而，mRNA 技術(shù)的發(fā)展并非一帆風(fēng)順，其中最大的挑戰(zhàn)之一便是副產(chǎn)物雙鏈 RNA（dsRNA）的形成。dsRNA 作為一種免疫刺激分子，會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而影響 mRNA 的安全性和有效性。因此，如何減少 dsRNA 的形成，成為 mRNA 技術(shù)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

傳統(tǒng)解決方案依賴繁瑣的純化工藝，但成本高、效率低，且難以徹底清除微量dsRNA。作為mRNA體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的核心工具酶，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的天然活性（如末端轉(zhuǎn)移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性）被認(rèn)為是dsRNA形成的關(guān)鍵因素，如何通過定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)改造T7 RNAP，成為全球科研團(tuán)隊(duì)競逐的焦點(diǎn)。

我們創(chuàng)新性的通過結(jié)合定向進(jìn)化和半理性設(shè)計(jì)的方法，成功篩選出多個(gè)高效低毒的T7 RNAP突變體，這些突變體在減少dsRNA形成方面表現(xiàn)出色。

我們構(gòu)建了隨機(jī)突變庫，設(shè)計(jì)了一種可實(shí)時(shí)監(jiān)測液滴內(nèi)RNA產(chǎn)物的完整性與dsRNA含量的分子信標(biāo)探針系統(tǒng)，利用熒光激活液滴分選（FADS）定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)行超高通量篩選。最終篩選出關(guān)鍵候選突變體Mut1（V214A）、Mut7（F162S/A247T）產(chǎn)生的dsRNA含量顯著低于野生型。

同時(shí)，團(tuán)隊(duì)通過半理性設(shè)計(jì)方法，構(gòu)建了十個(gè)單點(diǎn)飽和突變庫，并利用微孔板篩選技術(shù)來識(shí)別有益的突變體。其中，微孔板篩選使用了雙探針，增加的5’-end探針用于檢測RNA產(chǎn)量。在篩選超過1000個(gè)突變體后，發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵候選突變體Mut11 (K180E)、Mut14 (A70Q)產(chǎn)生的dsRNA含量顯著低于野生型，并且未影響轉(zhuǎn)錄效率。

為了進(jìn)一步優(yōu)化，團(tuán)隊(duì)針對上述突變位點(diǎn)構(gòu)建了DNA shuffling文庫，通過微孔板篩選，最終獲得組合突變體M17（A70Q/F162S/K180E）。實(shí)驗(yàn)顯示，M17的dsRNA含量僅為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。

這一結(jié)果不僅在體外實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證，還在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。團(tuán)隊(duì)將突變體轉(zhuǎn)錄的mRNA導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞后，最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達(dá)量僅為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細(xì)胞中，突變體mRNA的EGFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)顯著增加，且熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導(dǎo)的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。

為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機(jī)制，團(tuán)隊(duì)通過計(jì)算機(jī)模擬與功能實(shí)驗(yàn)，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉(zhuǎn)移酶活性而導(dǎo)致dsRNA的降低，這一發(fā)現(xiàn)為未來進(jìn)一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。

本研究為T7 RNAP的改造提供了新的方法與思路，也為 mRNA 技術(shù)的發(fā)展注入了新活力。通過減少dsRNA的形成，提升了 mRNA 的質(zhì)量和安全性。