干貨 | 鎂孚泰酶改造技術(shù)經(jīng)驗(yàn)分享：半理性設(shè)計(jì)全流程實(shí)戰(zhàn)解析！

# 1、獲取高質(zhì)量蛋白三維結(jié)構(gòu)

# 2、深入挖掘結(jié)構(gòu)信息

1）催化口袋邊緣的殘基(不直接催化，但影響底物定位)。

2）通道入口/出口處的殘基(影響底物進(jìn)入/產(chǎn)物釋放速率)。

3）靠近關(guān)鍵催化殘基或結(jié)合殘基(~5?內(nèi)，“第一配位圈”)，影響微環(huán)境(電荷、疏水性、空間)。

4）柔性Loop中可能調(diào)控構(gòu)象或穩(wěn)定性的關(guān)鍵殘基。

5）亞基界面參與相互作用的非核心保守殘基。

1）使用FoldX預(yù)測(cè)ΔΔG能量變化的熱點(diǎn)。

2）MD模擬中顯示關(guān)鍵相互作用頻繁變化的殘基。

3）深度掃描(結(jié)合DDGun, PopMusic等工具預(yù)測(cè)點(diǎn)突變影響)。

1）丙氨酸掃描：快速識(shí)別功能關(guān)鍵(Ala突變失活嚴(yán)重)或可塑性高(Ala突變影響中度)的殘基，后者常是優(yōu)化好靶點(diǎn)。

2）功能區(qū)域截?cái)?掃描：初步鎖定關(guān)鍵Loop或片段。

1）在共進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)中處于中心節(jié)點(diǎn)或與功能關(guān)鍵殘基強(qiáng)關(guān)聯(lián)的殘基。
2）MSA中在目標(biāo)功能（如熱穩(wěn)定性）上出現(xiàn)正選擇信號(hào)的非保守殘基。
3）在進(jìn)行殘基選擇的時(shí)候要控制數(shù)量與間距。單庫(kù)聚焦1個(gè)區(qū)域(如“底物通道入口”)或少量(2-4個(gè))鄰近/協(xié)同的殘基組合。避免對(duì)連續(xù)長(zhǎng)片段(>3個(gè)殘基)同時(shí)飽和突變(易破壞折疊)。組合庫(kù)中，優(yōu)選非連續(xù)或有間隔的殘基組合(降低沖突)。

# 1、構(gòu)建可篩選系統(tǒng)

• 遺傳互補(bǔ)、發(fā)酵上清/細(xì)胞裂解液中顯色/熒光底物的直接測(cè)定、抗生素抗性篩選(需設(shè)計(jì)好劑量)、表面展示等體內(nèi)篩選通量極高，但易得假陽性/假陰性。

• B在96/384孔板表達(dá)純化后酶活測(cè)定/高通量生化檢測(cè)(顯色/熒光/GC/HPLC-MS)、熱漂移法檢測(cè)Tm等體外篩選結(jié)果更可靠，但通量受限于表達(dá)/純化步驟。

# 2、分層篩選策略

• 目標(biāo)：從海量庫(kù)中快速富集潛在陽性，去除絕大部分無效克隆。

• 規(guī)模：幾百到幾千個(gè)克隆。

• 要求：高通量(96/384孔板)、速度快、成本低，精度可稍低。

• 方法：顯色法(微孔板讀數(shù))、基于熒光的活性測(cè)定、簡(jiǎn)單的抗性/顏色生長(zhǎng)篩選等。

• 關(guān)鍵：設(shè)定合理初篩閾值(如活性>WT均值+2SD)并平行復(fù)孔(2孔)減少誤差。

• 目標(biāo)：確證一級(jí)篩選陽性、定量比較、排除假陽性。

• 規(guī)模：幾十到幾百個(gè)克隆。

• 要求：更高精度、重現(xiàn)性、定量性，可加入第二關(guān)注的性能等指標(biāo)。

• 方法：小量表達(dá)純化后或使用高質(zhì)量裂解液進(jìn)行篩選。

• 關(guān)鍵：與野生型平行嚴(yán)格對(duì)照。建議測(cè)序驗(yàn)證突變。

• 目標(biāo)：對(duì)最優(yōu)克隆(5-10個(gè))進(jìn)行全面生化表征和應(yīng)用潛力評(píng)估。

• 方法：大量表達(dá)純化，全面測(cè)定詳細(xì)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)、穩(wěn)定性、選擇性、特異性、產(chǎn)物抑制、儲(chǔ)存穩(wěn)定性等目標(biāo)性能。